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非瘟試劑盒

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非瘟中盒5副本.png


非洲豬瘟病毒熒光定量PCR快速檢測試劑盒說明書

【獸藥名稱】

? 通用名︰非洲豬瘟病毒熒光定量PCR快速檢測試劑盒

? 商品名: 無

? 英文名︰African swine Fever Virus (ASFV) PCR Fluorescence Fast Detection Kit

【用途】

? 本試劑盒適用于檢測病料核酸中的非洲豬瘟病毒(ASFV)DNA,檢測結果可用于非洲豬瘟病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

? 本試劑盒利用針對非洲豬瘟病毒核酸保守區設計的一對特異性引物、一條特異熒光探針,配以PCR反應液等組分,在熒光定量PCR儀上,應用實時熒光定量PCR檢測技術,通過熒光信號的變化實現非洲豬瘟病毒 DNA的快速檢測。

PCR檢測體系含有陽性內對照(內標),通過檢測內標是否正常來監測待測樣本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假陰性。

【主要組成成份】

序號

試劑名稱

規格與裝量

主要成分

1

ASFV-黴混合液

100μl/管×1管

DNA聚合黴和尿嘧啶DNA糖基化黴

2

ASFV-內標

50μl/管×1管

含內標基因片段的克隆質粒

3

ASFV-核酸釋放劑

250μl/管×1

SDSTE

4

ASFV-PCR反應液

950μl/管×2管

引物、探針、dNTPs、鎂離子、PCR緩沖液

5

ASFV-陰性對照

50μl/管×1管

滅菌生理鹽水

6

ASFV-陽性對照

50μl/管×1管

含目標序列的克隆質粒

? 備注︰1)不同批號產品的成分之間不可以混用或互換。

【適用儀器】

? 適用于ABI7500熒光PCR儀、SLAN-96P、SLAN-24P熒光PCR儀等。

【樣本要求】

? 1.適用樣本類型︰血清、血漿、組織勻漿液上清等。

? 2.樣本保存和運送︰長期保存請置于-20℃以下。標本運送采用冰壺加冰或泡沫箱加冰密封進行運輸。

【檢驗方法】

? 1 ?試劑準備(在試劑準備區進行)

? 1.1 取出試劑盒中的各組分,室溫放置,待其溫度平衡至室溫,混勻後備用;

? 1.2 根據待測樣本、陰性對照、陽性對照的數量,按比例(反應液38μl/人份+黴混合液 2.0μl/人份+內標1.0μl/人份)取相應量的反應液、黴混合液及內標,充分混勻成PCR-mix,瞬時離心後備用。

? 2 ?樣本處理與加樣(在樣本處理區進行)

? 2.1 ?加樣

? 2.1.1每個PCR反應管中加入核酸釋放劑5μl(建議深吸淺打,避免出現氣泡),然後分別加入待測樣本、陰性對照、陽性對照各5μl,吸打3-5次混勻(輕輕吸打,避免出現氣泡);室溫靜置10分鐘以上。

? 2.1.2每管加入PCR-mix 40μl,吸打混勻2-3次,蓋上管蓋(去除氣泡後),2000rpm離心30 秒。

? 3 ?PCR 擴增(請參照各儀器使用說明書進行設置)

? 3.1 將PCR反應管放入擴增儀樣品槽,按對應順序設置陰性對照、陽性對照以及未知樣本,並設置樣本名稱。

? 3.2 熒光檢測通道選擇︰

? 3.2.1 SLAN 、ABI、Stratagene系列儀器︰

? 選擇FAM通道(Reporter:FAM, Quencher:none)檢測ASFV-DNA;2)選擇HEX 或VIC通道(Reporter:HEX/VIC, Quencher:none)檢測內標;3)參比熒光(Passive Reference)設置為none。設置Sample Volume為50。

? 3.3 循環參數設定(SLAN 24等具備12℃升降溫的儀器可執行FAST程序)︰

步驟

常規程序

FAST程序*

溫度

時間

循環數

溫度

時間

循環數

1

UNG 黴反應

50℃

2 分鐘

1

2

Taq 黴活化

95℃

2 分鐘

1

95℃

2 分鐘

1

3

變性

95℃

15

40

95℃

3

40

退火,延伸,熒光采集

60℃

30

60℃

20

4

儀器冷卻

25℃

10

1

3.3.1 ABI、Stratagene儀器參數設置(*注︰由于ABI7500儀器原因,不能設置為30秒,可以設置為31秒或32秒)

4. 結果分析(請參照各儀器使用說明書進行設置,以下分析以ABI系列儀器為例)反應結束後自動保存結果,根據分析後圖像調節Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用戶可根據實際情況自行調整,Start值可以在3~15、End值可設在5~20,調整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線),點擊Analyze進行分析,使各項參數符合下述“5. 質量控制”中的要求,然後到Plate窗口下記錄Ct值。

? 5. 質量控制

? 5.1 ASFV-陰性對照︰Ct值無顯示;但內標檢測為陽性,且Ct值≦40。

? 5.2 ASFV-陽性對照︰Ct值≦35。

? 5.3 以上要求需在同一次實驗中同時滿足,否則,本次實驗無效,需重新進行。

【參考值(參考範圍)】

? 通過參考值的研究確定本試劑盒檢測目標基因的Ct參考值為39,檢測內標的Ct參考值為40。

【檢驗結果的解釋】

? 1 ?陰陽性判斷︰

? 1.1 對于測定Ct值≦35的樣本,報告為ASFV- DNA陽性;

? 1.2 對于測定35≦Ct值<40的樣本,報告為ASFV- DNA可疑,需對該樣本復測,若Ct值≦40,報告為ASFV- DNA陽性,若Ct值>40,報告為ASFV- DNA低于試劑盒檢測下限。

? 1.3 對于測定Ct值>40 的樣本,同時,內標檢測為陽性(Ct值≦40),報告注明ASFV- DNA低于試劑盒檢測下限;若內標Ct值> 40或無顯示,則該樣本的檢測結果無效,應查找並排除原因,並對此樣本進行重復實驗(若重復試驗的檢測結果仍無效,請與本公司聯系)。

檢測方法的局限性】

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送及保存質量有關,其中任何失誤都將會導致結果不準確。如果樣本處理時沒有控制好交叉污染,可能出現假陽性結果。

【產品性能指標】

? 本試劑盒檢測企業工作參考品,陰、陽性符合率均為100%;精密度試驗表明批內和批間重復性好,檢測結果Ct值的變異系數均<10%,濃度值變異系數均<50%;本試劑盒最低檢出量為4.00E+02 copies/mL;

【注意事項】

? 1. 本品僅用于獸醫診斷使用,使用前請仔細閱讀本說明書。

? 2. 試驗前請熟悉和掌握需使用的各種儀器的操作方法和注意事項,對每次實驗進行質量控制。

? 3. 實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規範,實驗人員必須進行專業培訓,實驗過程嚴格分區進行,所用消耗品應滅菌後一次性使用,實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備,各區各階段用品不能交叉使用。

? 4. 所有檢測樣品應視為具有傳染性物質,實驗過程中穿工作服,戴一次性手套並經常替換手套以避免樣品間的交叉污染;樣本操作、廢棄物處理均需符合相關法規要求︰《微生物生物醫學實驗室生物安全通用準則》和《醫療廢物管理條例》。

? 5. 所有的試劑在使用前,均需在室溫下充分融化、混勻後使用。

【規格】50反應/盒

【儲存條件及有效期】試劑應避光密閉儲存于-20±5℃;試劑盒有效期為12個月,避免反復凍融。

【生產企業】吉林和元生物工程股份有限公司



更新時間︰2019-07-26

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